选择合适的抗体和纳米抗体进行荧光成像

欢迎参加我们的技术讲座，这是专门针对 SfN Connectome 2021 的。我们非常抱歉，这必须是虚拟的，我们真的希望在今年晚些时候我们能够可以再次与大家见面。所以今天讨论的是如何选择合适的抗体和纳米抗体进行荧光成像。我叫丽贝卡·东北 (Rebecca Northeast)，是一名欧洲技术专家，我将负责演讲的前半部分。后半部分将由我们 Chromotek 产品经理 Astrid 完成。

因此，我们首先向您介绍一些有关 Proteintech 的信息。如果您以前没有听说过我们，我们自 2002 年以来一直是抗体、ELISA 试剂盒和蛋白质的原始制造商。我们最近获得了 ISO 认证，这意味着我们可以生产 GMP 级细胞因子和生长因子用于细胞和基因治疗。我们在全球拥有五个库存地点，所有产品都有库存，可在次日交付。

Proteintech 拥有针对 13,000 个目标的多克隆和单克隆靶点以及抗体。其中，针对 2,500 个靶标的抗体已通过敲低、敲除验证验证了其特异性。这是抗体行业中覆盖范围最广的 KD/KO 验证抗体。今年，我们还推出了用于直接免疫荧光的 CoraLite 荧光染料抗体。Protientech 与其他抗体供应商的主要区别在于，我们生产 ev我们自己生产所有产品，您只能购买带有我们标签的产品。通过消除中间商并不允许其他任何人以其标签销售我们的产品，我们为您提供完全的透明度。这意味着批次间的一致性更高，因为除了直接来自实验室的庞大原始验证数据库之外，我们还可以保证供应，并完全控制抗体的质量，确保它在您手中发挥作用。我们还提供机会保留您首选批次的多克隆抗体的文件，以确保您将来有供应。作为一家公司，我们通过您的科学成功来衡量我们的成功，特别是帮助您更快地发表有影响力的研究。此图显示，纵观我们公司的历史，我们的产品每年都会出现在越来越多的出版物中，截至目前，我们的出版物被引用次数已超过 70,000 次。

因此 Chromotek 最近成为 Proteintech 的一部分2020 年集团。和 Chromotek最初是慕尼黑慕尼黑大学的一家衍生公司。从那时起，Chromotek 的使命是通过高性能抗体试剂和细胞生物学蛋白质组学支持非凡的发现，努力改进、加速和简化世界各地的研究。他们拥有超过 50 种独特的产品，被引用次数超过 2,500 次。所以请快速介绍一下我们。所以，正如我所说，我的名字是丽贝卡。我获得了博士学位。曼彻斯特大学神经科学和新陈代谢博士后。我于 2020 年作为技术专家加入 Proteintech，为客户提供网络研讨会和技术支持。阿斯特丽德·西特 (Astrid Sitte) 在哥廷根大学获得了生物化学博士学位，并在那里完成了博士后研究，重点研究肽合成。 Astrid 的学术和专业知识一直专注于完整的蛋白质表征，她于 2019 年加入 Chromotek 并领导 Chromotek 支持团队。简要概述一下今天的演讲。所以我会首先介绍用于成像的一抗和二抗，详细说明我们可用的多种选择之间的差异。然后，阿斯特丽德 (Astrid) 将接管并讨论纳米抗体在成像中的应用。

我们首先讨论一抗，但在讨论之前，先快速概述一下免疫荧光和免疫组织化学。那么，当我们用这些术语提到免疫时，我们的意思是什么？免疫简单地指抗体与抗原的结合。免疫组织化学代表组织内的抗原检测，免疫细胞化学代表细胞内的抗原检测。免疫荧光背后的基本前提是抗体与样品中所需的抗原结合。之后，添加二抗，该二抗与一抗结合，并且该二抗包含荧光团，该荧光团响应激发而发射特定波长的光。免疫荧光很特殊，因为它允许多重相互作用，因此您可以对同一张幻灯片中同一样品中的多种蛋白质进行成像。然后，假设您的一抗是在不同宿主中产生的或属于不同的 IgG 亚类，因此可以通过选择性适当的抗二抗来靶向。这就是免疫荧光的总体方案。我们首先从固定开始，可以使用有机溶剂（例如丙酮）或化学交联剂（例如 PFA 或甲醛）来完成。如果他们使用化学交联剂，而我们想要获取细胞内蛋白质，那么我们就必须进行透化步骤。然后进行封闭以尽量减少非特异性结合和[听不清00:05:27]抗体孵育。在这里我们可以进行间接或直接免疫荧光。间接是更常见的一种，您先与一抗一起孵育，然后与二抗一起孵育，中间有多个洗涤步骤以确保您去除系统中所有未结合的抗体。如果我们直接进行，那么只需对一抗进行简单的一步孵育，然后用合适的封固剂封固，然后进行显微分析。所以 Proteintech，我们为所有抗体提供特定于产品的实验方案，这些详细说明了我们在验证过程中发现最适合我们的具体最佳封闭条件以及稀释和孵育。所以我们有一个可以开始的地方。

这只是一个表格，概述了您可以使用的不同类型的抗体。因此，最常见的是多克隆，这些通常是在兔子中产生的，多克隆是针对整个抗原产生的，因此包含针对不同表位的多种不同的 IgG 分子。因此，它们具有高亲和力和高表位可及性。然而，多克隆抗体具有继承的批次间变异性，因为您由于抗体开发方式的性质，批次之间永远不可能获得相同的 IgG 混合物，并且样品中相似蛋白质之间也可能会出现一些交叉反应，因此这将导致特异性降低，并可能导致更高的结果背景。单克隆抗体仅含有针对一种表位的 IgG。它们最常见于小鼠体内，由杂交瘤作为单个血浆 B 细胞产生。与多克隆相比，它们的批次间变异性较低，并且背景也较低。这些抗体的优点是，如果在小鼠模型中使用，它们可以具有较高的背景，并且由于您仅识别一个表位，因此它们的亲和力也可能较低。重组抗体是单克隆抗体，与单克隆抗体一样仅识别一个表位。它们的制备方法略有不同，因为它们是通过体外克隆从免疫兔子或美洲驼中分离出的 IgG 的重链和轻链制成的。您还可以获得不含动物成分的 r直接从 DNA 文库制备的重组抗体。这些重组体非常适合多重实验，并且批次间变异性非常低，因为杂交瘤不存在遗传漂移。你只是从体外克隆中获得这些。由于只有一个表位被识别，您的靶点可用性和表位可及性可能会降低。那么我们什么时候使用我们的多克隆抗体呢？多克隆抗体用于大多数 IHC 实验，也用作交联组织。正如您在右侧的图中所看到的，我们有我们想要的蓝色蛋白质，我们的多克隆抗体正在识别其中的许多不同表位。然而，当我们与 PFA 交联时，其中一些表位会被化学交联隐藏，因此，表位可及性将会降低。因此，使用多克隆抗体，您更有可能识别您的目标蛋白。而且，因为我们可以识别多个由于表位不同，多克隆更适合低丰度的靶蛋白，因此可以放大靶信号。如果观察稀有物种，它们也更有可能做出反应。使用多克隆抗体的其他缺点是可能会出现交叉反应和高背景。那么我们什么时候使用单克隆抗体呢？单克隆细胞最适合资源密集型研究，这是因为它们可以通过杂交瘤生产进行规模化生产。不建议将它们用于小鼠模型，因为您可以获得高背景，并且还具有可靠的目标覆盖范围，因此您要寻找的大多数目标也将以单克隆格式提供给您的大多数供应商。然而，正如我之前所说，单克隆抗体的缺点是它们可能对表位变化敏感，因此无论是通过任何实验参数，还是仅通过 PFA 固定等，这都是仅具有表位被识别。那么我们什么时候想使用重组抗体呢？重组抗体最适合高通量染色和自动化，它们特别适合真正长期的产品，这是因为它们是基因定义的并且没有克隆漂移。因此，在批次之间，您将一次又一次地获得相同的抗体。它们也有工程上的特殊性。例如，如果您只寻找一种不同的蛋白质同种型，那么重组体可能会非常好。而且它们还可以通过高度可重复的大肠杆菌生产进行扩展。

重组抗体的缺点之一是您的目标覆盖范围可能会受到限制，因为目前出售的重组抗体并不多由供应商。然而，它们被吹捧为抗体的未来，因此随着时间的推移，将会有越来越多的针对不同靶标的重组抗体失败。

但是现在，简单介绍一下荧光素奥弗尔。您的荧光团可以直接连接到您的一抗或二抗上，当我们进行多重检测时，我们希望确保我们使用的不同荧光团的光谱轮廓具有最小的重叠。因此，正如您在此处的三种 CoraLite 颜色中看到的那样，如果将它们一起使用，当您查看不同的通道时，您将不会出现太多渗色。

还有两种不同的颜色一般来说，您可以使用两种类型的荧光团。因此，您有传统的荧光团，例如 FITC，但您也有合成荧光团，例如 Alexa Fluor 或 CoraLite。这些合成荧光团更亮、更耐光，因此，它们最适合共焦或低丰度目标，尤其是共焦，如果您长时间激发荧光团的话。例如，如果您正在执行拼接图像，那么您确实不要使用 CoraLite 或 Alexa Fluor 而不是 FITC 等，因为否则，这意味着它们不太可能漂白，并且随着时间的推移，您将获得不错的成像。所以正如我提到的，我们可以进行直接或间接染色。那么什么是直接呢？直接是您拥有一抗的地方，它直接与荧光团缀合，因此，您不必在其中添加任何二抗，并且更有可能获得特定信号。然而，您确实失去了间接染色的放大效果。因此，间接染色是指您有未标记的一抗，然后有二抗，该二抗附着在抗体的 FC 部分上，并且会附着荧光团。正因为如此，您可以获得两个、三个、四个二抗，仅附着在一个一抗上，因此，您可以获得这种信号放大。这些是直接和间接的优点和缺点。所以直接的一些好处是这样您就有了更短、更简单的实验方案，而且背景也有了很大改善，交叉反应性也更少，因此样品中的二抗不会出现任何非特异性结合。通过间接，您可以获得放大的信号和更大的灵活性，以便您可以将一抗与多种不同的二抗结合使用，为您的面板获得不同的颜色。尽管如此，这样做的一些缺点是它是一个稍长、更复杂的实验方案，并且您可以获得更高的背景。因此，在 Proteintech，我们最近推出了直接与我们的 CoraLite 荧光团缀合的一系列流行单克隆抗体。这些是 488、594 和 647，这是远红色的。 那么，我们什么时候使用我们的 CoraLite 抗体？因此，您可以将它们用于多重成像、细胞标记、细胞器标记和高浓度蛋白质。我们只看其中的几个例子。所以 CoraLite 非常出色。所以直接免疫荧光法是最好的例如细胞骨架标记物，即细胞角蛋白 18，以及右侧红色的 β 肌动蛋白。我们还可以查看细胞器。所以核纤层蛋白 B1 是核膜标记，或者在右侧，您可以看到这只小鼠心脏已被 N-钙粘蛋白染色，这是一个固有连接。您可以很好地看到此处概述的不同细胞器的定义。我们还可以查看特定的细胞标记。所以TUBB3是一种微管蛋白β3，它是微管的主要成分。我们将[听不清 00:14:19] GFAP，这又是一种常见的、非常常见的神经科学标记，因为它是一种星形胶质细胞标记，因此它可以标记 [听不清 00:14:30] 和类似的细胞。这里只是第一部分的快速总结。那么我们要使用哪种抗体以及何时使用？因此，多克隆适用于低丰度目标或如果我们有交联固定组织，也适用于初步研究工作。单克隆细胞适合资源密集型或长期研究因为我们的批次间差异最小，您可以非常快速地扩大抗体规模。再说一遍，对于重组，由于背景非常低，这些非常适合多重研究，而且由于随着时间的推移缺乏批次之间的变异性，因此也非常适合长期研究。那么我们想使用哪些技术呢？因此，正如我所说，直接染色对于丰度目标和多重分析确实非常有用。如果您想在一个样品中使用多种不同的兔单克隆抗体，那么您可以将它们直接缀合使用，从而避免出现任何问题。我们还有间接染色，这是更常见的一种，如果您有中等或低丰度的靶标，这些方法就很好。

现在，我们将简要讨论您可以使用不同的二抗。那么名字里有什么？现在，我将详细介绍二抗示例的这个超长且复杂的名称，并解释每个部分的含义以及它如何应用于您的经验评论。但首先，我们要从选择主机开始。因此，在选择二抗的宿主时，只要它是针对一抗的宿主（例如抗兔），那么一种抗体相对于另一种抗体并没有真正的任何显着优势。但您要确保您的二抗宿主与一抗宿主不是同一物种。你不想在你的研究中使用兔子、抗兔。还有一件值得注意的事情是，你应该使用宿主的血清作为封闭试剂。因此，在这个例子中，我们将使用正常的山羊血清，因此，这确实有助于最大限度地减少研究中二抗的任何非特异性结合。我们还可以对二抗进行不同类型的纯化，一般来说，所有二抗都会经过筛选对您选择的 IgG 的反应性。然而，一些抗体更进一步，在这里他们说\"交叉吸收”，这意味着有一个额外的纯化过滤步骤过滤掉与非目标物种结合的抗体。这些最常用于多重染色，但是，并非所有示例都需要它们，并且在大多数情况下，非交叉吸收的二抗将适合您。我们还可以获得不同的子类，这些子类基于关于您的 IgG 的同种型。因此，多克隆是 IgG 的混合物，如果您说\"IgG 重基因和轻基因”，这意味着您将针对 IgG 混合物。你的一抗的种类也决定了你的亚类混合物。所以在这里，例如，你可以在我们的例子中看到，这里的单克隆抗体，这是一个小鼠IgG抗体。这是因为小鼠有四种不同的 IgG 亚类：IgG1、2a 等。了解这一点非常有用，因为假设您有两个您有兴趣在实验中使用的鼠标单声道，然后您可以通过使用识别您的特定子类的辅助设备来复用这些不同的单声道。而且，请注意，您您可以获得片段一抗，因此这些通常称为 Fab 或 Fab2 片段，它们作为特定片段出售，非常适合组织渗透。它们也经常被使用，因为您希望最大限度地减少一抗 FC 区域与某些细胞类型上存在的某些 FC 受体的非特异性结合。因此，如果您这样做，您需要确保您拥有针对您的 Fab 片段的二抗。谢谢，丽贝卡。在开始纳米抗体部分之前，我只是想提醒我们的与会者，他们可以在聊天字段中添加他们已有的任何问题，我们将在随后的现场问答环节中回答这些问题。

现在，让我们来看看纳米抗体部分。我想从纳米抗体的定义开始，因为也许不是每个人都熟悉纳米抗体格式。因此，纳米抗体是源自羊驼的单域抗体，您可以在左侧看到还有一只羊驼。一个很好的动物。而羊驼和其他骆驼科动物不仅具有典型的 IgG 抗体格式，而且还具有一种特殊类型的抗体，这种抗体仅由抗体重链组成。当然，它们被称为重链抗体。您可以在此处看到绿色，即重链抗体突出显示的小部分，而这个上部结合部分就是纳米抗体。纳米抗体（通常也称为 VHH）大小为 15 千道尔顿，当您将其与荧光染料等偶联时，您可以轻松地将其用作研究试剂。然后，我们将其称为纳米助推器或纳米标签或纳米二级。然后将其与荧光蛋白融合，就称为染色体。这两种类型的纳米抗体试剂都可以很好地应用于成像。

所以让我们从纳米增强剂或纳米标签开始，我们的经验法则是越小越好。再说一次，纳米助推器或纳米标签是纳米博dy 与荧光染料偶联，其工作原理基本上与缀合一抗非常相似。因此，我们专门针对荧光蛋白（如 TFP 和 RFP）等一般目标开发了纳米增强剂和纳米标签。当带有染料的纳米抗体与您的细胞和论文中已有的 GFP 和 RFP 结合时，纳米抗体可以稳定、增强和重新激活荧光信号。当您想要最少的表位时，它特别有用使用染色试剂标记位移到您的目标。我们还提供针对 GFP、RFP、波形蛋白、组蛋白和 Spot 标签的纳米探针。可用的荧光团是 Alexa Fluor 和 ATTO 染料。纳米助推器和纳米标签的好处确实在于尺寸。那么你想什么时候使用它呢？当您想让标签和染料非常接近您的实际目标时。由于尺寸小，因此它们的尺寸仅为传统抗体的 1/10。你让你的染料接近目标，你就具有最小的表位标记位移，因此具有最小的连锁错误。由于尺寸小，纳米抗体还可以更好地渗透到更深的组织中，并且因为它们是单价的，所以它们不会聚集。因此，您可以轻松地将纳米抗体与一抗和二抗混合，并且不会形成簇。而且它们还可以重组表达，因此您还可以终身供应，而无需批次之间的差异。纳米增强剂和纳米标签适用于荧光显微镜。因此，对于 AP 荧光，也适用于共焦和超分辨率显微镜，如 STED 和 STORM。您从它们中获得的是更高的图像分辨率和更均匀的染色。在右侧，您还可以看到我们将纳米增强剂应用于 GFP 蛋白的示例。因此，您可以在左侧看到单独使用 GFP 时的信号强度。 GFP 通常会漂白，使用 GFP 增强剂后，我们的荧光信号至少会增加两倍。还有它显示在荧光图像上。因此，当您单独对 GFP 进行成像时，图像会因漂白而变暗，而使用增强器您可以恢复荧光信号。您可以重新激活它，您会得到非常漂亮的明亮染色。因此，在下一张幻灯片中，我想向您展示纳米助推器和纳米标签应用的三个示例。让我们从第一个开始。这是使用 GFP 和 RFP 增强剂对细胞核和线粒体进行的染色。因此，两个增强器同时应用于样品，您可以看到在共焦显微镜中获得了非常明亮、干净的图像。在这里的中间，我们有一个超分辨率显微镜的例子。这次，是 STED 显微镜，波形蛋白与黄水晶融合，因此荧光蛋白和 TFP 增强器可以检测黄水晶和融合，您会得到一个非常漂亮的高分辨率图像。而单独的黄水晶不会存活于 STED 成像中。在右侧，您会看到一个更特殊、更高级的应用程序助推器的化。这是组织透明化后对整只小鼠进行的染色。因此，在这种情况下，首先将 GFP 增强剂应用于样品，然后再清除组织。是的，当您想要对深层组织切片和深层组织切片进行成像时，这特别有用。

在我们的下一张幻灯片上，我们现在切换到我已经使用过的另一个产品组提到了纳米二级。正如名称所示，这些纳米抗体的作用类似于二抗。纳米抗体还与荧光染料融合，并以亚类特异性方式与小鼠或兔的一抗 IgG 抗体结合。纳米二抗与 Alexa Fluor 染料结合，并且它们也是重组制造的，因此批次之间的差异最小，标记程度高。它们对于共焦和超分辨率显微镜等显微镜技术也特别有用，并且客户重视您可以将它们用于多路复用方法。在右侧，您可以看到纳米二级技术的不同优势。让我们首先从更快的染色开始，因为纳米二级是单价的。您可以将二抗或纳米二抗以及一抗与样品同时孵育。因此，您可以进行简短的预混合步骤，然后将初级和纳米次级应用于样品。您可以看到，作为示例，我们尝试使用顺序染色对肌动蛋白进行染色。因此，首先是初级，然后是第二级，即纳米次级。我们可以得到一个很好的图像。通过上述一步染色，我们可以获得同样漂亮的图像，但您可以节省大量时间，因为您不需要第二次孵育和清洗步骤。纳米二级器件由于尺寸小，还可以提供更高的分辨率。因此，使用二抗，您的标签非常接近...使用纳米二抗，您的标签非常接近目标，这一点尤其重要进行超分辨率显微镜检查时需要。在右侧，我们想要展示的好处是更清晰的图像。因此，使用纳米二抗，您可以获得非常清晰的图像，因为它们具有子类特异性，因此它们仅与一个特定子类的 IgG 结合。它们具有较低的交叉反应性和非常低的背景，而这都是多重分析方法所需要的。现在，我想向您展示两个多重分析的示例。因此，让我们首先从使用不同的小鼠和兔一抗的样本开始。黄色部分，我们使用了针对核纤层蛋白的兔抗体。绿色部分，我们使用了针对 COX4（一种线粒体标记物）的小鼠 IgG1 抗体。在洋红色中，我们使用了针对微管蛋白的小鼠 IgG2b 一抗。我们使用了相应的三种不同的纳米二级，我们将该样品与所有三种原色和所有三种纳米二级同时孵育，可以获得无背景、无渗色的高分辨率图像。在我的第二个例子中，我想向您展示我们所说的三重小鼠染色。因此，我们在这里使用了三种不同的小鼠一抗，抗核纤层蛋白、抗 MOT 和抗波形蛋白。而且，对于这里的这个例子，我们同时孵育初级和纳米次级，并且可以获得非常好的多重图像，没有任何串扰或出血。

现在我会喜欢来到染色体，这是用于实时成像的纳米体。对于染色体，纳米抗体与荧光蛋白（例如 GFP）或 RFP 融合。要使用染色体，您基本上需要获得 DNA 构建体或质粒，然后用质粒转染细胞，并且细胞在典型的细胞周期中表达染色体。染色体的好处是您可以实时可视化内源蛋白质，并且它是非侵入性的，因为您不需要使用 CRISPR Cas 等技术来标记内源蛋白质。而你必须有内源性蛋白质，然后用​​细胞中的纳米抗体对其进行染色。并且不会干扰目标蛋白及其功能。染色体可用于不同的内源蛋白。肌动蛋白，例如 PCNA、组蛋白、核纤层蛋白。所以我们有不同的持家基因。在右侧，您可以看到一个例子，这里是一部短片，那里使用了核纤层蛋白染色体。是的，所以融合获得P蛋白，你看到它很好，这可以观察细胞分裂和细胞周期。所以我想总结一下纳米抗体的部分。 Chromotek 提供用于成像的纳米抗体工具。您可以使用纳米助推器和纳米标签进行超分辨率显微镜检查。当涉及较厚的组织时，纳米二抗可用于任何需要二抗的应用，但它们在超分辨率、显微镜和多重分析方面尤其有用。染色体对于生活方式成像很有用。现在，我想总结一下这是我们的整个谈话，还有丽贝卡的部分。我们认为我们会根据典型的抗体工作流程为您提供一些建议。因此，当您开始实验时，您会查看目标，而目标丰度通常很重要。因此，当目标丰度较低时，建议使用多克隆抗体，即一抗。当目标较高时，您可以使用单克隆或重组抗体。对于困难的目标，重组抗体也能很好地发挥作用。当你有一个高表达的靶标时，然后想想，如果你使用直接缀合的抗体，抱歉，例如，蛋白质技术公司的 CoraLite 染料和 CoraLite 缀合物。然后，当你开始你的项目时，你还要考虑抗体的量您拥有的样本或项目持续时间。因此，当您只有少量样品且项目持续时间短时，那么您完全可以选择多克隆抗体。但是当你有一个长期项目时如果你有很多样品，那么单克隆或重组抗体是有用的。关于应用，对于标准应用，您可以使用多克隆、单克隆或重组体。当您使用典型标签时，纳米助推器和纳米标签会很有帮助。当您想要观察目标生命细胞时，例如在活细胞中，那么染色体可能是合适的。关于二抗，当您的一抗是多克隆时，您可以选择，然后使用检测 IgG 重链的二抗和轻链，因为样品中的主要克隆中有不同的克隆。单克隆和重组，它们检测亚类特异性。它们也是特定于子类的，这意味着辅助设备需要检测某个子类。当涉及多重分析时，交叉吸收抗体和纳米二抗非常有用，纳米二抗对于超分辨率显微镜也非常有帮助。